摘要：目前, 关于甲型肝炎病毒 (HAV) 的致病性和宿主免疫反应的动物模型主要是以黑猩猩和狨猴为主的非人灵长类动物。此外, 树鼩、豚鼠、猪及基因敲除小鼠等都可在实验条件下感染HAV并可被选择作为替代的动物模型。本文将对实验感染HAV动物模型的研究状况进行综述。
关键词：甲型肝炎病毒; 实验感染; 动物模型;
甲型肝炎 (甲肝) 与戊型肝炎 (戊肝) 较为相似, 均为急性、自限性疾病, 通过粪口途径、人与人之间的接触或者污染的水和食物传播[1]。甲肝主要在卫生环境较差的发展中国家, 例如非洲、亚洲和南美洲的部分地区流行[2]。甲型肝炎病毒 (HAV) 是引起急性病毒性肝炎的主要病原体, 属于小核糖核酸家族的肝病毒属, 基因组全长约7 500 nt, 为单正链线性RNA病毒, 包括5’非编码区 (UTR) 、蛋白质编码区和3’非编码区 (UTR) 。HAV非常稳定, 具有耐热性和耐酸性, 这一点和其它小核糖核酸家族的病毒有所不同, 该特点利于病毒的传播[3]。HAV在血液中是以有包膜的颗粒形式存在, 而在粪便中则为裸露的、无包膜的颗粒形式[4]。目前, HAV被分为6个基因型 (I、II、III、IV、V、VI) , I-III型为人类起源, 每一型又可分为A、B两个亚型, 其中IA型在世界范围内最为流行。据报道, 全球每年有超过1 400万人新发HAV感染[5], 被感染的儿童通常没有临床症状, 而被感染的成人则会出现黄疸等其它临床症状, 感染之后可以获得终生免疫力。尽管由于卫生条件改善等因素, 全球范围内人群中甲肝抗体的阳性率在日益下降, 导致了部分地区人群对甲肝的暴发流行缺乏免疫力, 因此甲肝仍然是一个值得关注的公共卫生问题。
如同乙型肝炎病毒 (HBV) 和丙型肝炎病毒 (HCV) , HAV的宿主主要局限于人类和非人灵长类动物[6]。但是HAV可成功在小鼠及豚鼠细胞中培养, 提示其可能有其它种类的宿主存在[7-8]。目前为止, 关于HAV的致病性和宿主免疫反应的动物模型主要是以黑猩猩和狨猴为主的非人灵长类动物[9], 尚不能准确复制该病毒的致病过程的小型动物模型。本文将对甲型肝炎目前的动物模型研究情况进行分类综述。
1. 非人灵长类动物
虽然HAV可成功感染非人灵长类动物, 但是即使在非人灵长类动物中, 该病毒的宿主范围也相当有限, 对HAV最为敏感的非人灵长类动物主要是狨猴和黑猩猩, 而这两种动物的资源十分稀缺, 饲养和实验操作都很困难。因此, 我们仍需要在考虑到实验条件、经济条件和伦理范畴的情况下, 选择最佳研究HAV的非人灵长动物种类。
1.1 狨猴
在过去很长一段时间内, 由于HAV不能在细胞培养中分离且缺乏可以成功感染的动物模型, 因此对于该病毒的研究一直处于停滞阶段。1969年, Deinhardt等人[10]尝试用甲肝病人血清感染狨猴, 5只中的两只在感染后出现了临床症状, 并且能够传染给其它狨猴。随后, 多个实验室通过分离甲肝病人的血清并感染狨猴, 证实不同种类的狨猴对HAV易感[11-14]。
虽然甲肝是通过粪口途径传播, 但研究发现在狨猴中, 静脉注射HAV比口服病毒的感染效率更高, 且注射剂量越高, 狨猴的甲肝潜伏期就越短, 血清和粪便中出现阳性指标也更早[15]。其原因可能是经静脉注射后, 病毒能够迅速定植于肝脏并进行繁殖, 而经口途径感染的病毒须先在肠粘膜等部位定植, 之后才能入侵血液并定植于肝脏, 在肝内进行复制并形成感染病灶。
狨猴感染甲肝后, 临床症状并不明显, 只有轻微的厌食及体重下降。在感染HAV后平均1~5周, 狨猴血清中谷丙转氨酶 (ALT) 和谷草转氨酶 (AST) 开始出现升高, 随着病程发展达到峰值并可持续3~4周, 这表明狨猴出现了急性肝炎并发生了肝脏损伤[16-21]。在感染病毒后一周左右, 可以在狨猴排出的粪便中检测到HAV RNA及HAV抗原, 狨猴的粪便排毒可持续20~30 d。通过对感染甲肝的狨猴的不同器官的检查, 发现不仅在肝脏中能检测到HAV抗原, 在胆囊、脾脏等肝外器官中也可检测到[19-21]。大多数狨猴在肝脏损伤伊始便开始产生抗-HAV Ig M抗体, 在达到峰值2~3周后发生血清学转换并产生抗-HAV Ig G抗体[19-20]。利用光镜、电镜、免疫电镜和过氧化酶标记抗体等方法进行组织学方面的检测, 可以发现肝炎的组织学变化, 例如肝细胞嗜酸性变、肝脏细胞坏死和凋亡、气球样变性、肝巨噬细胞增殖等, 病毒颗粒可出现于肝细胞、肝巨噬细胞及微胆管上皮细胞等[20-21]。
此外, Provost等人的研究表明, 向狨猴注射HAV的野毒株和经细胞培养传代的疫苗株后, 狨猴对于二者的反应有所不同, 经过细胞培养传代的疫苗株所引起的肝脏生化及组织学的指标均有所下降, 而且病毒在肝内的复制和粪便中排出量也相应减少[22-23]。因此狨猴不仅可作为甲肝病毒感染的动物模型, 也可作为测试毒力指标的模型。
1.2 黑猩猩
自然环境下, 黑猩猩感染HAV和抗-HAV抗体存在的几率较高, 约有90%的野生黑猩猩携带抗-HAV的抗体, 故不适合用作HAV感染研究, 并且导致了在过去的实验条件下用HAV感染新捕捉的黑猩猩的失败率较高[24]。随着对于抗-HAV抗体的血清学检测方法的发展, 人工培育的黑猩猩可以通过血清中的抗-HAV抗体筛选并选择阴性者进行感染实验, 随后许多研究均表明黑猩猩可以成功感染HAV[25-26]。
虽然甲肝的传播是通过粪口途径, 但同狨猴一样, 对黑猩猩进行静脉注射病毒的感染率高于经口感染, 而且注射剂量越高, 潜伏期也越短[15]。黑猩猩在感染HAV后, 会出现轻度的急性肝炎相应的临床症状, 但临床症状一般比较轻微[27]。在感染病毒后14 d, 可在黑猩猩血清中检测到病毒, 病毒血症持续大约两周, 而粪便排毒出现在感染病毒后10 d左右, 可持续3周[27-29]。感染病毒21 d后, 除了粪便及血清中可检测到病毒外, 还可在黑猩猩肝脏以及胆汁、扁桃体、唾液等中检测到HAV抗原, 并可用免疫电镜观察到病毒颗粒[28-31]。随后, 可在黑猩猩血清中检测到甲肝抗体的出现及抗体的血清学转换[30-32]。感染病毒后15~30 d天左右, 黑猩猩血清中的转氨酶等生化指标升高达到最高值[30-33], 而血清学指标的上升通常是肝脏损伤的直接证据。此外, Maynard等人[34]的研究结果表明, 在感染了HAV的黑猩猩的血清中, 可检测到循环免疫复合物, 可能与体内对病毒清除的机制以及相应的免疫反应有关, 而循环免疫复合物在患有甲肝的人类中很少有所关注。
虽然黑猩猩是研究甲型肝炎的理想动物模型, 并且之前对于HAV的致病性研究主要依赖于黑猩猩为主的动物模型, 然而由于价格昂贵、来源困难, 饲养条件苛刻、实验操作复杂, 因此其在医学及生物学研究中具有一定的局限性, 有些国家已经明令限制黑猩猩用于实验, 并倡导使用替代的实验动物[35]。
1.3 其它非人灵长类动物
除了狨猴及黑猩猩, 还有研究表明HAV可以成功感染夜猴、食蟹猴、短尾猴、恒河猴、松鼠猴等其它种类非人灵长类动物[36-41]。这些种类的非人灵长类动物, 在感染HAV后, 均可以出现血清转氨酶的升高、粪便排毒、抗-HAV抗体的产生以及肝脏病理学改变等肝炎引起的表现[36-41], 但相较于狨猴和黑猩猩而言, 这些非人灵长类动物虽然能够被HAV感染, 其粪便排毒、肝脏酶学改变、肝脏病理学改变等, 均变化不明显。此外, 也有研究表明恒河猴、卷尾猴、绿长尾猴以及枭猴在注射了HAV之后, 只产生抗-HAV抗体而没有产生肝炎的表现[42], 这些结果的差异可能是由于动物种类的不同, 也可能是由于所选用的动物在入组前已经被感染了, 需要重复验证。
1.3.1 食蟹猴
通过对自然状况下食蟹猴的血清检测, 发现野生食蟹猴在自然环境中可以感染HAV, 感染HAV后其ALT等酶学指标也会相应上升, 而且食蟹猴的抗-HAV抗体血清阳性率与体重成正比[43-44]。在对食蟹猴进行HAV感染后, 没有出现人类患急性肝炎时的临床表现, 但其ALT等酶学指标相应升高, 其粪便、血清中可检测到HAV RNA, 血清中的抗-HAV抗体也呈阳性, 同时肝脏出现相应病理学改变[39,45,46]。此外, HAV也可在食蟹猴的肝外器官如唾液腺进行复制[39]。
1.3.2 恒河猴
与食蟹猴类似, 在感染HAV之后, 恒河猴的粪便中可以检测到HAV RNA, 血清中也相应出现抗-HAV抗体, 但其肝脏病理性变化较为轻微, 并且其中一些感染HAV的恒河猴ALT等酶学指标仍处于正常范围内[45,47-48]。
1.3.3 夜猴
在自然环境中, 夜猴可被HAV感染, 并且夜猴之间也可相互传染, 但感染后的抗体阳性率较低[36]。通过静脉注射或者经口途径, 均可成功使夜猴感染HAV, 感染后夜猴出现粪便排毒、抗-HAV抗体的产生以及ALT等酶学指标的升高, 组织学结果也表明肝脏出现类似于人类肝炎变化, 例如坏死、退行性变、炎性细胞增生等现象[37-38,49]。
总之, 在非人灵长类动物中, 目前对HAV最为易感的是黑猩猩和狨猴, 其它种类的非人灵长类动物虽然也可以成功感染HAV, 但临床症状、生化指标、肝脏病理学改变等不如黑猩猩和狨猴明显。HAV的宿主范围局限在人类和非人灵长类之中而且非人灵长类动物感染HAV的疾病过程与人类较为相似, 故之前的研究主要采用非人灵长类动物, 但由于其资源稀缺, 且饲养困难、实验操作复杂, 故亟需建立可替代的实验动物模型。
2 其它种类动物模型
2.1 猪
Song等人[50]在460份不同年龄段的猪的血清中, 用酶联免疫吸附实验 (ELISA) 方法检测出猪在自然环境下抗-HAV抗体阳性率为3.5%。随后, 他们分别通过经口及静脉注射对猪进行了HAV感染, 病毒血症及粪便排毒均在注射病毒后一周左右出现, 而抗-HAV抗体则在病毒注射后28 d出现, 持续时间为15 d。此外, 只有静脉注射组的猪出现了抗-HAV抗体, 而经口感染组的猪没有出现抗体。通过对猪的肝脏组织学检测, 可发现炎性细胞浸润等组织学变化, 在肝外组织中, 淋巴结等组织也出现了相应的病理学改变。但是, 被感染的猪均没有出现发热、黄疸等肝炎的临床表现, 而且经感染的猪血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶及总胆红素水平与对照组猪并无显著性差异。Song等人认为[50], HAV可以在猪的体内复制, 猪可替代非人灵长类动物, 成为HAV感染的动物模型。但猪在感染HAV后, 其临床表现及血清标志物水平均没有显著变化, 用于感染相关的研究仍有局限。
2.2 豚鼠
由于HAV可以在豚鼠细胞中成功培养[51], 提示HAV的复制可能不局限于灵长类动物细胞中。2001年Hornei等人[52]尝试HAV能否在实验条件下感染豚鼠, 通过经口及静脉注射对豚鼠进行了病毒感染后, 他们发现在感染后2-3周, 豚鼠开始出现粪便排毒及病毒血症, 经口感染的豚鼠出现的时间晚于静脉注射者。感染60 d后, 对豚鼠肝脏进行组织学检查, 发现明显的炎性浸润及肝细胞坏死等改变, 另外, 豚鼠的小肠、淋巴结、脾脏等肝外组织也发生了病理性改变。但是, 在整个感染过程中, 豚鼠血清中均没有出现抗-HAV抗体, 谷草转氨酶、谷丙转氨酶等生化指标也与对照组豚鼠没有显著性差异。Hornei等人[52]认为豚鼠没有出现抗体及生化指标异常的原因是所注射的病毒载量较低, 故认为豚鼠适宜作为研究HAV感染所引起的病理改变的模型, 但不适宜作为比较抗体、生化指标的模型。
2.3 基因敲除小鼠
之前研究表明, HAV的复制能够被I型干扰素抑制[53], 而且被HAV感染的黑猩猩体内的I型干扰素反应被明显抑制[54], 因此Hirai-Yuki等人[55]给I型干扰素受体和II型干扰素受体双敲除的小鼠静脉注射了HAV, 结果发现双敲除小鼠出现了粪便排毒及低水平的病毒血症, 血清谷丙转氨酶水平也有所升高。感染后28 d, 双敲除小鼠血清中可以检测到抗-HAV抗体, 感染后37~41 d, 小鼠肝脏也出现了肝细胞凋亡和坏死等病理学改变。
随后, Hirai-Yuki等人又用HAV分别感染了线粒体抗病毒信号分子 (MAVS) 敲除小鼠和I型干扰素受体敲除小鼠, 发现二者在感染7 d后, 均出现粪便排毒, 感染15 d后能够在肝脏中检测到病毒RNA。然而, 只有I型干扰素受体敲除小鼠出现了谷丙转氨酶水平的升高和肝细胞坏死等组织学改变, 线粒体抗病毒信号分子敲除小鼠则没有显著改变。因此, Hirai-Yuki等人认为, I型干扰素受体敲除小鼠可以作为研究HAV的动物模型, 而且线粒体抗病毒信号分子介导的干扰素信号通路可能与肝脏损伤有关。但由于其为基因敲除小鼠, 制备较为困难、繁琐, 且不能模仿生理情况下对HAV感染的反应, 故应用受限。
2.4 树鼩
树鼩是一种介于食虫目和灵长目之间的动物, 在我国广西、云南等地区分布广泛, 因其与猴类等相比, 数量较多, 具有对多种人类疾病的易感性, 如乙肝、丙肝等[56-58], 故具有重要的科学研究价值。
詹美云等[59]用5%的甲肝病人粪便悬液, 通过经口感染方式感染了9只树鼩。结果表明, 感染后树鼩没有出现明显的急性肝炎的临床表现。在感染后7~13d, 有7只树鼩出现粪便排毒现象, 并且持续12~27 d, 说明HAV能够在树鼩体内进行繁殖。在感染后2~16周, 有78%的树鼩血清中出现了抗-HAV的抗体, 但抗体的滴度比较低, 可能和病毒毒力或者树鼩的免疫力有关。此外, 部分树鼩出现了ALT等肝脏相关酶学指标的升高, 以及肝脏充血、水肿等病理学改变。这些结果都提示HAV可以在树鼩的体内进行复制。树鼩在我国数量较多, 资源丰富, 故可作为甲型肝炎的动物模型而被使用。但由于其没有明显的临床表现且出现粪便排毒的比率不高, 故在相关研究中仍具有局限性。
综上所述, 由于非人灵长类动物能够模拟人类罹患甲肝的自然病程及转归, 仍是甲肝相关研究的理想动物模型。而在非人灵长类动物之中, 又数黑猩猩和狨猴对甲肝病毒最为易感, 感染HAV后能够产生类似人类感染的临床症状, 并且不同研究结果一致。其它种类的非人灵长类动物模型对于感染HAV后产生的临床症状不同学者报道有所差异, 故这些种类的非人灵长类动物作为HAV感染的动物模型仍有待证实。总之, 非人灵长类动物还是目前最适合作为HAV感染的动物模型, 但由于其数量稀少、饲养困难、实验操作复杂, 以及动物伦理及保护等考虑, 因此, 已有规定在实验中限制使用非人灵长类动物的数量。此外, 树鼩、豚鼠、猪及基因敲除小鼠等, 都可在实验条件下感染HAV。但是这些种类的动物作为HAV感染的动物模型仍然不够理想, 在临床表现、实验室指标、病理改变等方面都与灵长类感染HAV不尽相同。虽然这些动物均有局限性, 但仍可被选择作为替代的甲肝动物模型用于相关实验研究。
3. 展望
近年来, 由于我国卫生环境条件的改善以及甲肝疫苗的普遍接种, 我国甲肝的患病率有所下降, 但每年新增的甲肝患者数量告诉我们, 甲型肝炎仍然是一个不容忽视的公共卫生问题。目前, 在HAV的发病机制及抗病毒药物等方面的研究仍比较缺乏。随着对于HAV感染的实验动物模型的进一步研究, 人们对于HAV的致病机制也会认识得更加深入, 而这对于防控甲型肝炎也有重要意义。
